循环DNA的临床应用研究进展

　　摘  要：循环DNA（circulating DNA）是存在于血液（血浆或血清）、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA，其量和性质的改变在肿瘤、感染性疾病、产前诊断、创伤和自身免疫性疾病的诊断和预后判断以及器官移植的监测等方面具有重要意义。

　　关键词：循环DNA  诊断 预后

　　早在1948年，法国学者Mandel和Metais1便发现了人类血液循环系统中游离于细胞外的核酸物质——循环DNA的存在。但在其后的近30年时间内，对于循环DNA的研究只局限于自身免疫性疾病2，而且，其定量检测也仅仅限于基于DNA抗体的放射免疫技术3、4。1975年，Steinman5等采用四种不同的检测方法确定正常成年人血浆血清DNA含量在10-30ng/ml范围内，并发现，循环DNA含量高于100ng/ml提示疾病的存在。之后，随着生物技术飞速发展，多种灵敏的DNA定量检测方法应运而生，包括：缺口平移法6、竞争PCR7、荧光检测法8，紫外分光光度法9和实时荧光定量PCR8等。技术的发展推动了循环DNA的研究（图1），大量文献表明，各种类型疾病患者血浆血清DNA存在量和性质的改变，这些变化具有很大的临床意义和诊断价值。

图1  Pubmed数据库搜索循环DNA相关文章，显示其数量不断增长

搜索词：("DNA/blood"[MeSH] OR "DNA/cerebrospinal fluid"[MeSH] OR "DNA/secretion"[MeSH] OR "DNA/urine"[MeSH])

　　一、肿瘤

　　循环DNA的临床应用价值在肿瘤方面研究最多，特别是对于缺乏可靠诊断方法的实体瘤。方便无创的样本取材使得循环DNA成为最具发展前景的检测对象。

　　循环DNA定量检测

　　1977年，Leon等4首次报道肿瘤患者循环DNA水平显著高于正常人，且与病人的预后及疗效有关。此后的大量研究都证实了这一点，并且显示了一定的临床意义（表1）。

　　1983年，Shapiro等10采用放射免疫法对良恶性胃肠道疾病患者血清DNA进行定量检测，发现恶性患者血清DNA含量（412 ng/ml）显著高于良性患者（118 ng/ml），虽然其水平与肿瘤大小及部位无关，但联合CEA检测，对于消化道肿瘤，特别是胰腺癌的诊断，具有很高的敏感性和特异性。1990年，Maebo11采用斑点杂交技术检测肺癌病人血浆DNA含量，结果显示，肺癌患者、良性肺疾病患者和正常人这三者之间存在显著差异，且可用于疗效监测，当联合血清CEA，检测敏感性达78%。1995年，FOURNIÉ等12以缺口平移标记技术发现肺癌患者血浆DNA含量显著高于正常对照，IV期肺癌患者血浆DNA含量显著高于其他分期患者。

　　虽然早期定量检测技术的敏感性较低，但多数结果显示了循环DNA含量在正常与肿瘤之间的差异，为后期的研究奠定了基础。

　　科技的迅猛发展为循环DNA定量研究提供了崭新的技术平台，1996年，Heid13研究报道了用于核酸定量检测的新技术——荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）。二十一世纪，以实时荧光定量PCR为主要技术的DNA定量方法已被广泛应用。2002年，Thijssen 8等同时采用荧光定量法和实时荧光PCR技术定量测定结直肠癌伴肝转移患者血清血浆DNA水平，发现血清DNA含量升高与肿瘤转移有关，而根据血浆DNA水平可判断患者的预后。2003年，Sozzi等14以hTERT基因为标准衡量肺癌患者循环DNA水平，结果显示，肺癌患者血浆DNA平均含量（24.3ng/ml）高于正常对照（3.1ng/ml），ROC曲线下面积为0.94，能很好的区分肿瘤与正常。2004年，Allen 15和Gal16则针对人类β-globin基因分别确定前列腺癌和乳腺癌患者循环DNA含量，前者研究表明，循环DNA水平可作为良恶性前列腺疾病诊断的指标，以1000 GE/mL为cutoff值，诊断敏感性为85%，特异性为73%；而以血清DNA含量221 ng/ml为cutoff值，可作为乳腺癌患者预后指标。同年，对肺癌患者血浆DNA研究17显示血浆DNA定量检测可作为肺癌的筛查实验；Gautschi等的研究18表明非小细胞肺癌患者血浆DNA与临床分期及生存相关；Camps Herrero C等19采用分光光度法对非小细胞肺癌患者血清DNA定量检测的结果亦与临床分期有关。

　　然而，最近的研究结果不容乐观。2005年，分别对前列腺癌20、胸部恶性肿瘤21及乳腺癌患者22循环DNA的定量研究显示，标本的收集和处理、DNA提取及检测方法对于DNA定量结果影响很大，而且由于缺乏高敏感性和特异性，仅能作为辅助检测方法，却无临床诊断价值。

表1  肿瘤循环DNA定量研究结果

　　遗传性和表观遗传性改变的检测

　　自从Stroun等23通过生物化学特性的研究，证实了循环DNA的肿瘤细胞源性，癌基因抑癌基因的突变24、25、微卫星改变26、染色体重排27及DNA甲基化28-35等标志性事件在各种类型肿瘤患者循环DNA中相继被发现。肿瘤特异性分子遗传和表观遗传改变为肿瘤的早期诊断开辟了新天地。

　　癌基因抑癌基因的突变

　　1994年，Vasioukhin36和Sorenson37分别在骨髓增生综合征、急性髓细胞白血病和胰腺癌患者血浆DNA中检测到肿瘤细胞特异性N-ras和K-ras2基因点突变的存在。此后的研究表明，K-ras基因突变经常存在于消化系统恶性肿瘤（包括胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌等）患者的血清血浆中，其检测对于肿瘤的早期诊断38-43、预后判断44-45、复发监测46及疗效评估47都有重要的临床意义。

　　P53基因是一种抑癌基因，它在细胞分裂增殖生长过程中起重要的调控作用，研究发现，在多种肿瘤中p53基因的多个外显子存在突变。循环DNA p53基因突变最先在一例神经胶质瘤患者的脑脊液中被检测到48，此后，在膀胱癌患者尿液中亦发现突变的存在49。对结肠癌患者血清DNA中肿瘤特异性遗传改变的研究50发现，在肿瘤组织存在p53突变的10例患者中，有7例其对应的血清DNA中亦存在相同的改变；另项研究51亦在17例大肠癌患者中有3例血浆DNA p53突变阳性。随后的大量研究表明，乳腺癌52、58、60、肺癌52、55、63、头颈部恶性肿瘤53、59、结直肠癌54、64、肝癌56、57、61、62等多种恶性实体肿瘤患者循环DNA的p53基因存在点突变。最新的一项研究65采用电喷雾电离光谱分析技术，针对肝细胞癌患者血浆中p53基因发生突变的DNA进行定量测定，发现以2500copy/ml为正常值上限，具有临床诊断价值。

 　　DNA的甲基化改变

　　5’末端区域启动子高甲基化与多种抑癌基因表达失活有关66，这些抑癌基因包括p14ARF、p16、DAPK、GSTP-1、MGMT、APC、E-cadherins、RASSF1A等，他们在细胞周期调控、细胞分裂增殖及细胞凋亡中起至关重要的作用。

　　1999年，Esteller等67首次对肺癌患者血清DNA中多种抑癌基因（P16、DAPK、GSTP1、MGMT）启动子甲基化进行了研究，同时研究了其与多种临床参数（临床分期、组织病理、复发及临床结局）的相关性，研究表明，肺癌患者血清DNA中存在抑癌基因启动子高甲基化改变，且与组织DNA中高甲基化高度一致，然而，由于样本含量较小（n＝22），未能发现临床相关性。

　　从此，关于肿瘤循环DNA甲基化及其临床意义的文献报道纷至而出68-74，所有研究（无论血浆或血清标本）表明，肿瘤循环DNA中存在多种抑癌基因启动子高甲基化改变，其中，也不乏得到临床相关性的报道（表）。

　　Sanchez-Cespedes等71分析了95例头颈部肿瘤患者血清DNA中4种抑癌基因启动子高甲基化状态与肿瘤分期、肿瘤大小、部位及淋巴结转移的相关性，研究表明，启动子甲基化与否和肿瘤的分期及淋巴结转移有关（P<0.05），并且预示着肿瘤的转移和复发；Lecomte等72联合P16甲基化和K-ras突变研究显示与结直肠癌患者的预后相关；Zou等74发现P16甲基化与结直肠肿瘤分期有关。

　　然而，仅仅根据高甲基化现象，我们依然无法对肿瘤进行准确有效的诊断、分期及预后判断。

　　1999年，Lo等75首次将荧光定量PCR与MSP结合并尝试对肿瘤组织DNA甲基化进行定量测定；2000年，Eads等76发展了更为敏感的甲基化定量检测技术——MethyLight,从而为肿瘤循环DNA甲基化定量检测奠定了技术基础。

　　2002年,Usadel等77采用荧光定量MSP技术检测了肺癌患者血浆血清中APC基因启动子发生高甲基化改变的DNA水平，文中衡量甲基化DNA水平的标准是甲基化率（荧光强度甲基化APC：荧光强度内参照基因MYOD1×100）。研究结果显示，肿瘤组织中APC启动子高甲基化阳性率高达96%（95/99），血浆血清DNA中高甲基化检测敏感性虽不如组织，亦达到47%（42/89），而健康对照人群（n=50）全部阴性，显示了100%的特异性；另一方面，甲基化阳性标本的甲基化率平均值：肿瘤组织为7.33（0.001-346.8）、血浆血清为0.36（0.01-11.5），虽然平均值差别很大，但比较这两类标本甲基化率，并未发现统计学差异，由此，笔者认为，血浆血清APC启动子甲基化定量检测比定性检测更能真实的反映组织的甲基化情况，从而为肿瘤临床提供更准确可靠的信息。临床相关性研究表明，肺癌组织甲基化水平与患者预后有关（P=0.006），而血浆血清中未能发现该相关性，这可能与标本的不均一（既有血浆又有血清）有关。

　　2004年，Hoque78对肾癌患者血清及尿液中游离DNA的多种抑癌基因（CDH1、APC、MGMT、RASSF1A、GSTP1、p16、RAR-β2和ARF）启动子高甲基化进行半定量研究，由于采用多基因联合检测，其敏感性（94％－16/17）明显高于以往仅仅针对单个基因的报道；而甲基化DNA相对定量结果显示，肾癌患者血清及尿液中抑癌基因启动子发生高甲基化改变的DNA水平明显高于正常对照组，然而，没有发现任何临床意义。同年，Wong等79采用标准曲线法对鼻咽癌病人血浆中游离DNA的多种抑癌基因（CDH1、DAPK1、p15、p16、RASSF1A和MLH1）启动子高甲基化进行绝对定量测定，并研究其与患者性别、肿瘤分期及淋巴结转移的关系，结果也无相关性。虽然最近的研究80再次证明了多基因联合检测的高敏感性（57%），并且发现与肿瘤分期的相关性，但是，这些都仅仅限于定性结果，而定量结果好像是多余的，毫无意义的。

　　微卫星改变和染色体重排

　　对于肿瘤微卫星改变的研究目前存在很多争议。首先，其检测方法多种多样，缺乏可比性，检测敏感性较低，可能是由于检测样本中正常DNA背景太高的缘故；其次，有研究发现，正常对照组和肿瘤组织微卫星改变阴性的患者循环DNA中存在微卫星的改变81-85，这种假阳性被认为与循环DNA的低水平有关；第三，微卫星改变对于肿瘤诊断缺乏特异性。

　　虽然存在的问题很多，但不乏临床相关性的报道。在对非小细胞肺癌患者血浆DNA微卫星改变的研究86中发现，I期及病灶小于2cm的患者其阳性检出率分别为43%和45%，为临床早期诊断提供依据，该检测敏感性为61%（30/49），特异性达86%（30/35）。一项肺癌前瞻性研究87表明，在13例支气管活检阳性患者中，有12例血浆DNA亦存在相同的微卫星改变，诊断阳性率高达92%（12/13），支气管活检及血浆DNA检测敏感性分别为30%（13/44）和41%（12/29）。而对黑素瘤患者血浆DNA微卫星改变的研究88显示其预后判断及临床指导的作用。最近的一篇报道89显示了尿液DNA中微卫星改变与膀胱癌患者复发的关系。

　　染色体重排与遗传的关系更为密切，常发生于血液系统恶性肿瘤。Frickhofen等90报道了非霍杰金淋巴瘤和急性前B淋巴母细胞性白血病患者血浆血清DNA中免疫球蛋白基因序列的重排。

　　循环DNA定性及定量结果与临床分期之间的相关性为预后判断和治疗方案奠定了理论基础，随访研究亦为患者的生存及疗效判断提供了理论依据，循环DNA为肿瘤的无创检查提供了全新的思路。

　　二、感染性疾病

　　外源性病原体，特别是病毒感染是威胁人类健康的一类疾病。包括爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）91-98、人乳头瘤病毒（human papillomavirus）99-101及乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus , HBV）102-105等在内的常见的病毒感染性疾病与许多恶性肿瘤的发生发展关系密切，因此，对于这些外源性病毒DNA的载量检测，可以为临床诊断、预后及疗效判断提供帮助。

　　鼻咽癌在中国南方和东南亚发病率很高，几乎所有的患者都有EB病毒感染。1999年，Lo等91、92采用实时荧光PCR技术定量检测鼻咽癌患者血浆中的EB病毒DNA，并对接受放疗的患者进行了长期随访研究。其中一项研究91显示，95%（55/57）的患者血浆EBV DNA阳性（平均含量：2105 copies/ml），其水平与疾病分期相关,而正常对照组阳性率仅为7%（3/43平均含量：0 copies/ml）；在15例放疗患者中，有7例肿瘤消退病情好转，其血浆EBV DNA含量由治疗前的阳性转为阴性，而另外8例治疗无效的患者中，6例血浆HBV DNA持续在高水平。另项研究92亦表明了循环EBV DNA含量的变化与患者预后、疗效及复发的关系。最近的报道98则显示了血浆EBV DNA对于霍杰金淋巴瘤的无创诊断价值。

　　人乳头瘤病毒感染是宫颈癌的重要原因之一，随着病毒DNA整合到人基因组中，肿瘤不断进展，同时也为采用PCR技术进行检测带来了难题。采用传统的PCR基因扩增技术，Dong等99在232例宫颈癌中，仅检测到4.8%的血浆HPV DNA阳性，可能与基因整合导致扩增位点的消失有关。2003年的两项研究100、101表明早期宫颈癌患者血清HPV DNA阳性提示预后较差，可作为疾病复发的监测指标。

　　乙型肝炎病毒感染与肝细胞性肝癌的关系很早就被阐明，血浆血清HBV DNA载量与患者恶性转归密切相关102、103，且可提示患者的预后情况104。

　　循环病毒DNA的检测显示了广阔的临床应用价值，特别是EB病毒DNA在血浆血清中含量高，检出阳性率高，为相关性恶性肿瘤的诊断、预后判断提供了新的手段。

　　三、产前诊断

　　传统的产前诊断需要通过羊膜穿刺或绒毛膜来采集胎儿样本，易对胎儿造成创伤。1997年，Lo等106首先在孕妇血浆血清中检测到来自胎儿的DNA，且在孕三个月胎儿DNA就存在于母体循环系统中，其含量随着妊娠时间的延长而升高107，从而为产前无创诊断开辟了新的途径。同时，胎儿DNA在孕妇循环血浆中占的比例远高于在母体血细胞中所占比例108，因此更适合作为检测的对象。

　　Y染色体是最先被检测的母体血浆中胎儿DNA标志物106，通过定量测定孕妇血浆中的Y染色体基因片段，可确定来自男性胎儿的DNA含量，母体血浆中胎儿DNA含量的异常与疾病存在相关，其量的异常已经被证实与多种疾病相关，如早产109、110、胎儿染色体异常111-113、先兆子痫110、114-120、羊水过多121、异位胎盘110、122、妊娠剧吐123等。通过对母体血浆中胎儿DNA RhD特异性序列的检测，可确定RhD阴性孕妇胎儿的RhD血型124、125，2001年，该项技术已被英格兰国家血液中心应用于临床126。随着研究的深入，越来越多的疾病可通过循环胎儿DNA检测，如地中海贫血127、软骨发育不全128、肌强直性营养不良129、囊性纤维变性130及先天性肾上腺增生131、132等。

　　孕妇血浆血清中胎儿DNA检测使产前无创诊断成为可能，随着对循环胎儿DNA本质的不断探索133、134，在不久的未来必将成为产前临床重要的检测手段。

　　四、外伤与中风

　　循环DNA含量与外伤患者的伤势严重程度相关135，亦与中风患者严重程度相关136。还有研究表明，医院死亡率与血浆DNA高水平有关137，该检测指标可用于急诊科室。2006年，Chiu TW等的一项对烧伤病人的前瞻性研究138显示，血浆DNA含量的升高与患者严重程度（包括烧伤面积和深度等）及住院时间长短有关，Laktionov等亦发现外伤患者血浆DNA含量与外伤后器官衰竭有关139。Lam等研究发现，血浆DNA早期及持续升高提示外伤病情的严重程度141。血浆特异性DNA，如线粒体DNA140含量亦在发生外伤后显著升高。

　　在一项对84例外伤患者的研究142中发现，外伤后4h以内，患者血浆DNA含量明显升高，平均为正常对照的60倍，在外伤患者中，并发ALI及ARDS或死亡的患者血浆DNA含量平均为伤势较轻患者的11-12倍，以2.3×105 copy/ml为cut off值，预测敏感性80%-100%，特异性100%。通过分类回归分析（the classification and regression tree），血浆DNA与其他各类外伤指标，如损伤评分143-145、白细胞记数146、休克指数143、147等联合，可很好的预测外伤患者的病情预后。

　　五、自身免疫性疾病及器官移植

　　1966年，Tan148首先发现系统性红斑狼疮患者具有高水平循环DNA，而其他自身免疫性疾病患者循环系统中亦含有游离的DNA，如类风湿性关节炎149。随后的研究证实了上述观点150-155，并认为，①系统性红斑狼疮患者血清DNA含量升高 ②血清DNA含量升高与疾病严重程度有关。2001年，Chen等156采用琼脂糖凝胶电泳方法分析了系统性硬化症患者循环DNA特征，发现与正常对照组之间的不同条带，为其诊断提出了新的思路。

　　1998年，Lo等157发现不同性别肝、肾移植者血浆中含有来自供者的DNA。有研究表明，血浆DNA与细胞死亡有关158，因此，移植受者血浆中来自供者的DNA可作为移植排斥、巨细胞病毒、血管并发症等的指标159。

　　六、问题及展望

　　1．正常参考范围

　　早在1972年，Richard等160通过对186名健康人血浆DNA定量检测，确定其正常平均值为13.9 ± 3.7 mg/liter，此后，大量关于循环DNA的研究报道都检测正常人血浆血清DNA水平。1975年，STEINMAN5等确定正常成年人血浆血清DNA含量在10-30ng/ml范围内，并发现，循环DNA含量高于100ng/ml提示疾病的存在。目前大多数研究表明，正常人血浆DNA平均含量在10ng/ml左右5、12、14、17、21，而血清DNA平均含量则显著高于血浆，且各个研究结果差异较大4、16、20、161。

　　虽然血浆DNA正常值研究结果较为统一，但多数报道都只是将正常人循环DNA含量作为患者的对照，因此样本含量少，年龄范围窄，不能代表健康人群的全体。Wu等161定量检测了100名大学生血清DNA含量，平均值为57.1ng/ml，95%可信区件间上限为118.3ng/ml；同时测定了不同年龄段健康体检者血清DNA含量，确定中国台北地区男性和女性正常值上限分别为86.6 ng/ml 和81.8 ng/ml。鉴于循环DNA在各种病理疾病状态下含量的升高，对于其在健康人群中正常范围的确定非常必要，这就需要大范围大样本的研究，甚至进行流行病学的调查。

　　2．来源、性质及清除

　　1995年，FOURNIÉ12检测其他肺癌肿瘤标记物，发现小细胞肺癌患者的NSE、血清LDH水平与DNA含量成正相关，推测血浆DNA含量的升高与细胞死亡有关，并从两点证明了血浆DNA的肿瘤源性：①小细胞癌患者血浆DNA含量与来源于肿瘤细胞的NSE相关，②带有人源性肿瘤的裸鼠血浆DNA与人肿瘤细胞DNA可杂交。但是，DNA释放的机制未明。

　　2001年，Jahr163通过动物模型实验，证实凋亡和坏死会引起明显的循环DNA水平升高，推测肿瘤特异性DNA通过上述两种状态进入循环系统；同时运用荧光定量MSP技术检测30例肿瘤患者血浆DNA中CDKN2A启动子甲基化状态，发现高甲基化CDKN2A含量从3%-93%不等（这可能与肿瘤类型的不同有关），综合前述报道77-80，推测不同程度癌细胞的坏死凋亡（可能由于病人自身免疫水平不同或肿瘤类型不同引起）决定了肿瘤特异DNA释放的多寡。

　　然而，凋亡和坏死是否肿瘤特异DNA唯一来源？是否还存在其他未知的影响因素？最新报道164提出：肿瘤特异循环DNA主要来自活跃的而不是凋亡和坏死的癌细胞。如果真是如此，我们有必要重新审视肿瘤特异循环DNA的临床意义。

　　3．研究方法的统一

　　⑴ 标本的选择和采集

　　研究循环DNA所采用的标本包括血浆和血清，目前普遍认为，血清DNA含量明显高于血浆3、18、69，推测可能由于血液凝固过程中白细胞破坏引起的DNA释放，因此，血浆DNA水平能真实的反映体内情况8，比血清更适合作为研究的标本对象。

　　循环DNA是游离于细胞外的DNA，如何确保血浆收集过程中血细胞（主要是白细胞）的有效去除是保证实验结果真实可信的基础，但就是上述简单而必要的问题，直到2001年，才引起人们重视。Rossa W. K. Chiu等70比较了不同离心速度去除白细胞的效率，发现只有高速离心（16000g×10min）才能将血浆中的白细胞有效去除,而之前绝大多数研究都采用低速离心的方法，从而造成了结果的不确定性。

　　⑵ DNA的提取

　　无论何种提取方法，都会造成DNA的丢失；每种方法对DNA的提取效率有高有低71；同一种方法对不同类型标本的提取效率也存在差异。因此，如果两篇独立的关于甲基化定量研究报道采用不同的DNA提取方法，即使其它实验条件都一样，得到的实验结果依然无可比性；即使荧光定量结果再准确，由于提取时DNA丢失的不确定性，我们也不能用它来准确衡量提取前循环DNA的真实水平，鉴于上述原因，各循环DNA定量研究结果也就难以相互比较。

　　⑶ 标本保存

　　研究表明，无论是全血、血浆或纯化的DNA样本，随着保存时间的不同，其DNA含量会发生显著变化，这种改变对于大样本回顾性研究结果会产生很大的影响165。

　　七．结语

　　人体液循环DNA在临床诊断中的广阔应用前景虽有待进一步研究，但作为一种极有价值的临床实验诊断检测研究对象，它具有明显优点。首先，它克服了既往临床实验诊断取材困难的缺陷，如：产前诊断和肿瘤的诊断及监测多办需要特定部位所取的样本材料。同时，人体液循环DNA作为一种核酸，它突破了通常体液中被检测分析的微量蛋白质、脂肪及糖类等有机大分子无法在人体外被扩增的限制，因而，它显著地提高了肿瘤转移及复发方面的监测和对肿瘤微小残留病诊断的敏感性。当然，对体液中循环DNA的研究尚有许多方面有待进一步深入，循环DNA的起源尚未完全明了，其提取程序的标准化以及其量和性质的改变在临床诊断中对检测的特异性和敏感性的影响等方面的问题仍有待进一步完善与解决。

 　　（参考文献略）