应用ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)

田海梅 李艳芬 吴健雄 曹冬艳 荣维淇 刘毅 李茉 王海鹏 王小兵 张伟
中国医学科学院肿瘤医院肿瘤所 生物检测中心 腹部外科，北京 100021

　　摘要：目的 探讨用ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA）研究大肠癌药敏的异质性和个体化疗的可行性。 方法 用ATP-TCA检测58例大肠癌标本对16种单药或联合用药的敏感性。结果 个体之间的药物敏感性存在着明显的异质性。单药中最有效的药物为长春瑞滨、羟基喜树碱、氟尿嘧啶和紫杉醇。联合用药最有效的是氟尿嘧啶+丝裂霉素+阿糖胞苷，91.6%（11/12）的标本对其敏感，其次是氟尿嘧啶+顺铂+阿霉素, 健择+顺铂和5-FU氟尿嘧啶+长春新碱+卡氮芥。结论 大肠癌对抗癌药物的敏感程度存在着异质性。ATP生物荧光肿瘤药敏检测技术可用于为大肠癌选择合适的化疗药物。
　　关键词: ATP生物荧光肿瘤药敏检测技术 大肠癌

　　大肠癌是常见的肿瘤之一，属化疗中度敏感类肿瘤。由于发现时多已属中、晚期，术后需辅助化疗。每个病人对不同化疗药的敏感性不同，在化疗前为病人筛选出敏感性药物，进行个体化治疗，有助于提高化疗的疗效。本研究采用现在较为先进的ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA），对58例新鲜大肠癌手术标本进行药敏检测。
　　1 材料与方法
　　1.1 临床资料
　　58例标本取自本院2002年3月－2004年7月就诊的大肠癌病人，其中57例是手术标本，1例是结肠癌皮下转移的活检标本。均经病理学证实为大肠癌，其中结肠癌21例（腺癌20例，印戒细胞癌1例），直肠癌（腺癌）37例；TNM分期为I-II期32例，III期25例，IV期1例。病人中男性33人，女性25人；年龄30－81岁，中位年龄58岁。术前1人接受过放疗，1人接受过介入治疗，4人曾经手术。
　　1.2 主要仪器和试剂
　　荧光测定仪MPL1型（德国Berthold公司）；ATP生物荧光肿瘤药物敏感性检测试剂盒（北京金紫晶生物医药技术有限公司），含混合消化酶、培养基、红细胞去除液、细胞培养板（96孔）、ATP提取液和荧光酶－荧光素工作液。
　　1.3体外药敏检测实验
　　新鲜的大肠癌标本，在含抗生素的培养基中浸泡25分钟后，剪成0.5～1 mm3碎块，置于50 ml离心管中，加入10 ml含混合消化酶的培养基，于37℃消化2h。160目筛网过滤，获得单细胞悬液，用培养基洗涤2次。台盼蓝染色，计数活的肿瘤细胞。
　　先加待测药物于96孔培养板，所用药物及100％TDC（测试药物浓度）（100％TDC参考药物在人体内的血浆峰值浓度）见表1，联合用药的每个药物浓度与单药浓度相同。每个药物设100％、50％、25％、12.5％、6.25％TDC五个浓度，每个浓度2个平行孔，并设2排（8孔）无药孔作对照，一排为无药对照（M0），一排为最大抑制对照（MI）。接种肿瘤细胞，细胞数为2×104个/孔。在37℃，5％CO2条件下培养5d后，按试剂盒说明书操作，测定荧光值，并计算IC50和IC90。

表1 所用的化疗药物及剂量
 

　　1.4 药敏检测判定标准：
　　参照Kurbacher等[Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-7]的判定标准：高度敏感：IC90<100％TDC, IC50<25％，以＋＋＋表示;部分敏感：IC90>100％TDC, IC50<25％，以＋＋表示;低度敏感IC90<100％TDC, IC50>25％，以＋表示;不敏感: IC90>100％TDC, IC50>25％，以－表示。

　　2 结果
　　2.1 不同大肠癌标本对化疗药物单药的体外敏感性
　　58例大肠癌标本进行了4至16种单药和/或联合用药的药敏检测，其中44例仅选用了4至16种单药，3例仅选用3至8种联合用药药物，11例选用了单药和联合用药（共16种）。表2显示大肠癌标本对16种单药的敏感性。结果显示，大肠癌对单药对敏感性普遍较差，对HCPT、MMC、THP、NVB和5-FU的高度敏感率为分别为4.7％、3.1％、2.5％，2.0％和1.8％，而对其余10个单药对高度敏感率为0。如将高度敏感率和部分敏感率之和定义为敏感性（下同），那么敏感性的顺序为NVB>HCPT>5-FU>PTX，分别为34.0％、30.2％、29.1%、25.0％，其余12种单药的敏感性均低于20％；CBP的活性最差，所有29例大肠癌标本无一对其高度敏感或部分敏感，仅5例（17.2％）标本对其显示低度敏感。进行了单药药敏检测的55例标本中，有8例（14.5％）无敏感药物，17例（30.9％）有1个敏感药物，16例（29.1％）有2个敏感药物，10例（18.2％）有3个敏感药物，3例（5.5％）有4个敏感药物，1例（1.8％）有6个敏感药物。

表2大肠癌标本对单药的敏感谱
 

　　2.2 不同大肠癌标本对化疗药物联合用药的体外敏感性
　　表3显示的是8组二药或三药的联合用药结果。大肠癌标本对PTX+CBP的敏感性为21.4％，并不高于PTX单药（25.0％）；同样，5-FU+DDP组的敏感性为23.1％，5-FU+MTX+ADM组的敏感性为25.0％，联合用药并不高于5-FU单药29.1％。VP16+CBP组的敏感性为16.6％，略高于VP16单药（11.4％）。结果表明PTX与CBP、5-FU与DDP、VP16与CBP之间，5-FU与MTX、ADM无协同作用，提示PTX+CBP，5-FU+DDP和VP16+CBP三组联合用药可能并无优势。另外二组含5-FU的联合用药5-FU+VCR+BCNU和 5-FU+DDP+ ADM的敏感性分别是40.0％和53.9％，优于5-FU单药29.1％。5-FU+MMC+Ara-C组的敏感性最高，为91.6％，明显高于5-FU和MMC的单药敏感率之和47.3％，提示5-FU+MMC+Ara-C联合用药可能优于5-FU或MMC单药。

表3大肠癌标本对联合用药的敏感谱
 

　　本研究有11例大肠癌标本同时进行了5-FU、ADM、5-FU+DDP和5-FU+DDP+ADM的药敏检测，结果见表4。大肠癌标本对5-FU+DDP+ADM的敏感程度与对5-FU或5-FU+DDP的敏感程度基本相符，仅有3例（例8－10）ADM的加入使敏感程度提高。这表明5-FU+DDP+ ADM的抗癌活性主要来自5-FU或5-FU+DDP，ADM的作用较小。

表4 11例大肠癌标本对5-FU、ADM、5-FU+DDP和5-FU+DDP+ ADM的敏感谱
 

　　本研究有9例大肠癌标本同时进行了5-FU、MMC和5-FU+MMC+Ara-C的药敏检测，结果见表5。所有9例大肠癌标本对5-FU+ MMC+Ara-C敏感程度均高于5-FU和MMC单药。

表5 9例大肠癌标本对5-FU、MMC和5-FU+ MMC+Ara-C的敏感谱
 

　　图1、2所示的单药和联合用药的抑制作用结果来自同一标本。如图1所示，抑制作用高低依次是5-FU+DDP+ADM、5-FU+DDP、5-FU和ADM，但4条曲线较为接近。图2中5-FU+ MMC+Ara-C的抑制作用远远高于MMC和5-FU。

　　3 讨论
　　ATP生物荧光法是一个测定胞内ATP含量的技术。因为细胞死亡后，胞内的ATP被迅速水解。所以，所测得的胞内ATP含量可以反映出存活细胞量。因此，ATP生物荧光法常被用于抗肿瘤药物的体外药敏检测。本研究用这项技术对58例新鲜大肠癌手术标本进行药敏检测。
　　药敏结果显示，在进行了单药药敏检测的55例大肠癌标本中，有8例（14.5％）无敏感药物，17例（30.9％）有1个敏感药物，16例（29.1％）有2个敏感药物，10例（18.2％）有3个敏感药物，3例（5.5％）有4个敏感药物，1例（1.8％）有6个敏感药物。结果表明，来自不同个体的大肠癌标本对化疗药物的敏感程度有明显的异质性，该技术能敏感地反应出细胞对药物作用异质性的存在。
　　实验结果显示，大肠癌对单药对敏感性普遍较差，对HCPT、MMC、THP、NVB和5-FU的高度敏感率为分别为4.7％、3.1％、2.5％，2.0％和1.8％，而对其余10个单药对高度敏感率为0。这个结果与大肠癌属化疗低度敏感的临床观察相符合。
　　目前大肠癌化疗方案以5-FU为主。本研究的5-FU单药敏感性为29.1%，与临床报道的单药有效率21％基本相符[4]。羟基喜树碱对大肠癌也有一定疗效，临床报道单药有效率为5％～20％，我们的体外药敏为30.2％，与之基本符合。另外NVB和PTX可能也有一定的疗效。
　　5-FU+DDP+ADM是临床治疗大肠癌的常用化疗方案。本研究的结果显示，5-FU+DDP+ ADM联合化疗的敏感率明显高于5-FU单药（53.9％ vs 29.1％）。5-FU+DDP+ADM的敏感程度基本与5-FU+DDP或5-FU的敏感程度一致，提示ADM对联合方案的有效率的贡献可能很小。
　　Ara-C与5-FU同属于抗代谢药物，一般常用于恶性血液病的治疗，在消化道肿瘤治疗上也有应用。我们的体外药敏结果显示，5-FU+MMC+Ara-C的抗癌活性最高，58.3％的标本对其强敏感，33.3％的标本对其中度敏感，总敏感率高达91.6％。提示5-FU+MMC+Ara-C联合用药在临床上可能有较好的疗效。
　　另外，我们的药敏结果还显示，PTX+CBP、5-FU+DDP、VP16+CBP和5-FU+MTX+ADM四组联合用药可能并不能提高疗效。5-FU+VCR+BCNU联合用药的疗效可能高于5-FU单药。
　　化疗在大肠癌的综合治疗中有着重要的价值。但仅凭临床经验选择化疗药物有较大的盲目性。在使用化疗药物之前，对其进行敏感性检测，筛选出敏感药物，以减少用药的盲目性和因盲目用药所造成的不良反应。特别是对大肠癌这样的化疗低度敏感肿瘤，个体化治疗尤为重要。我们的结果初步证明，ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术可用于为大肠癌筛选敏感性药物。单药中，NVB、HCPT、5-FU和PTX抑癌活性较高；联合化疗方案中，最值得推荐的是5-FU+MMC+Ara-C，其后依次为5-FU+DDP+ ADM、GEM+DDP和5-FU+VCR+BCNU。由于体内和体外环境差异巨大，我们实验的标本量较少，体外药敏检测和体内疗效的相关性还需要进一步研究。
　　参考文献
　　[1] 傅军，张伟：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及其临床应用研究进展 中国肿瘤临床与康复 2004. 11（3）：274－277
　　[2] 田海梅，石小燕，张伟等：三磷酸腺苷生物荧光法卵巢肿瘤组织标本体外药敏试验 中华肿瘤杂志，2005.27（5）：296－298
　　[3] Kurbacher CM, Cree IA, Bruckner HW etal. Use of an ex vivo ATP luminescence assay to direct chemotherapy for recurrent ovarian cancer. Anticancer Drugs. 1998 Jan;9(1):51-7
　　[4] 潘启超，胥彬. 肿瘤治疗学与化学治疗学. 第2版. 郑州：河南医科大学出版社，2000. 262